By this author

Quantitative analysis of biomolecular condensates on a modified support

Issue number 1 from 01.01.2025

Биомолекулярные конденсаты представляют собой скопления биополимеров, образующиеся в водных растворах по механизму разделения фаз “жидкость–жидкость”. Нарушения фазовых переходов белков и нуклеиновых кислот в клетке лежат в основе ряда патологий, и необходимость их моделирования in vitro стимулирует развитие методов исследования конденсатов. В данной работе рассмотрена ключевая проблема визуализации конденсатов меченых белков и РНК методом флуоресцентной микроскопии в бесклеточных моделях. Она сводится к тому, что подвижность конденсатов в слое образца на стекле осложняет обработку и интерпретацию данных. Для ее решения ранее предлагалось иммобилизовать конденсаты на модифицированной подложке – стекле, обработанном 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС). Такая подложка предполагает нековалентное связывание РНК/ДНК и неоптимальна для белковых конденсатов. С помощью обработки АПТЭС N,N′-дисукцинимидилкарбонатом нами была получена альтернативная подложка ДСК-АПТЭС для ковалентного связывания конденсатов по лизиновым остаткам экспонированных на поверхности конденсата белковых фрагментов. Сравнительный анализ образцов известных конденсатов на всех трех типах подложки выявил значимое снижение их подвижности на модифицированной (АПТЭС или ДСК-АПТЭС) подложке, причем оптимальный тип модификации зависел от состава конденсатов. Эффективная иммобилизация улучшила качество фокусировки, что проявилось в повышении показателя солокализации олигонуклеотидного и белкового компонентов, а также упростила количественный анализ разделения фаз на основе объемной доли конденсатов в образце. Для идентификации конденсатов и автоматизации расчета их доли была разработана программа Droplet_Calc. Полученные с ее помощью данные подтверждают преимущества АПТЭС и ДСК-АПТЭС в сравнении с немодифицированным стеклом при анализе концентрационной зависимости доли конденсатов для построения фазовых диаграмм. Оптимизация подложки и автоматизация обработки изображений открывают возможность быстрого и надежного количественного анализа фазовых переходов биополимеров методами микроскопии, что может быть востребовано в скрининге терапевтических агентов для разрушения патогенных конденсатов.

57 0