By this author

Single-Domain Nanobodies for Determination of Conformational Changes in Transferrin and Their Use in Fluorescent Polarization Immunoassay

Issue number 2 from 09.11.2025

Трансферрин (Tf) в плазме крови существует в двух формах: железосодержащей holo-Tf и железонесодержащей apo-Tf формах. Количественное соотношение этих форм в плазме крови человека – важный биохимический маркер заболеваний, связанных с дефицитом или избытком железа. Применение метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPIA) и использование рекомбинантных нанотел верблюда в качестве распознающего реагента для экспрессного определения holo-Tf и apo-Tf позволит разработать быстрые метод определения двух конформаций трансферрина. Синтезированы и охарактеризованы конъюгаты нанотел верблюда aTf1 и aTf2 к holo- и аpo-формам Tf человека c флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Подобраны концентрации конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 (2.5–5 нМ) с оптимальным соотношением сигнал/шум и исследована кинетика связывания FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf методом поляризации флуоресценции. Показано, что полное связывание конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf наблюдается через 15 и 5 мин инкубации соответственно. Определены равновесные константы диссоциации комплексов FITC-aTf1*holo-Tf и FITC-aTf2*apo-Tf, которые составили 30.7 ± 0.3 и 15.3 ± 0.2 нМ, соответственно. Продемонстрировано, что инкубация конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с другими белками человека – лактоферрином, сывороточным альбумином и лизоцимом – не приводит к изменению сигнала поляризации флуоресценции, что свидетельствует о высокой специфичности анализа. Показано, что пары реагентов FITC-aTf1/apo-Tf и FITC-aTf2/holo-Tf не демонстрировали связывания между собой, что подтверждает аффинность конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 к holo- и apo-Tf, соответственно. В данной работе показана возможность определения двух форм трансферрина в физиологических жидкостях человека методом FPIA, которое может иметь диагностическое значение, а применение портативного флуоресцентного анализатора позволит проводить данный анализ вне стен специализированных лабораторий.

43 0