By this author

Construction of a Producer Strain of the Fibrinolitic Enzyme PAPC Based on Yeast

Issue number 5 from 01.05.2025

Дрожжи нашли широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности как микробные клеточные фабрики рекомбинантных белков за способность к гетерологической сверхэкспрессии многих целевых белков, в том числе протеолитических ферментов. Протеаза-активатор протеина С (PAPC) плазмы крови из микромицета VKM F-4104D потенциально может быть внедрена в терапевтическую практику в качестве фибринолитического лекарственного средства, а также в диагностические системы для анализа свертываемости крови в роли основного компонента, активирующего протеин С. Для решения задач по применению протеазы-активатора протеина С в медицине и ветеринарии важно иметь надежную систему продукции рекомбинантного фермента. Такая система продукции может быть создана на основе дрожжей. Цель данной работы заключалась в создании штамма-продуцента PAPC на основе дрожжей и демонстрации успешной продукции и секреции протеолитического фермента в культуральную жидкость. Нами был сконструирован вектор, несущий ген . Этим вектором были трансформированы дрожжи , проведена селекция трансформантов на среде, содержащей антибиотик зеоцин. При помощи селекции на агаризованной среде с казеином, а также анализа культуральной жидкости методом белкового электрофореза в ПААГ были отобраны наиболее эффективные клоны-продуценты целевого фермента. Исследована динамика накопления активной формы PAPC в культуральной жидкости после индукции белкового синтеза при глубинном культивировании продуцирующего клона в колбе. LC-MS-анализ подтвердил присутствие фермента в культуральной среде, а также показал, что его накопление происходит в зрелой ферментативно активной форме. Полученный в результате работы штамм-продуцент может быть использован для дальнейшего получения экспериментальных промышленных партий фермента на биотехнологических производствах, поддерживающих проведение дрожжевой ферментации.

4 0