Статьи автора

Трехпетельные токсины гадюк – клонирование кДНК и экспрессия в с использованием химерной (гибридной) конструкции с белком-партнером SUMO

Номер выпуска 5 от 01.05.2025

Трехпетельные токсины (ТПТ) образуют одно из наиболее обширных семейств токсинов змеиных ядов. ТПТ характерны для большинства ядов аспид, но практически не встречаются в ядах гадюк. С использованием ядовитых желез гадюк и был получен 21 клон кДНК, кодирующий эту группу токсинов. Из полученных последовательностей кДНК были выведены аминокислотные последовательности 9 ТПТ. Установленные последовательности имеют сигнальные пептиды, содержащие 19-21 аминокислотный остаток, за которыми следует зрелый белок, состоящий из 67 остатков. Все ТПТ гадюк относятся к группе нетрадиционных (non-conventional) токсинов, а их последовательности содержат 9 остатков цистеина. ТПТ, кодируемый одним из транскриптов, был получен гетерологической экспрессией в клетках в виде гибридного белка с растительным белком-партнером SUMO с последующим отщеплением специфичной растительной протеазой Bd-SENP1 и хроматографической очисткой. Структура полученного белка подтверждена методом масс-спектрометрии. Анализ его биологической активности показал, что этот токсин – слабый антагонист никотиновых холинорецепторов нейронного α7 и α3β2 подтипов. С использованием гибридного белка с SUMO мы также попытались получить ТПТ Aze-2 гадюки , аминокислотная последовательность которого была установлена нами ранее в результате транскриптомного анализа ядовитой железы , а сам белок в минимальных количествах был идентифицирован в яде этой змеи. Однако токсин, точно соответствующий по массе Aze-2, с использованием этого подхода получить не удалось. Таким образом, в результате работы были установлены аминокислотные последовательности 9 ТПТ гадюк, один из которых был получен экспрессией гена в клетках и проявил способность взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами нейронного α7 и α3β2 подтипов.

2 0

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ТРЕХПЕТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ ЗМЕЙ И КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА

Номер выпуска 5 от 01.05.2025

Визуализация макромолекулярных комплексов – важная задача современной биоорганической химии, которая может быть реализована с помощью различных методологических подходов. Наиболее широко используются методы с применением радиоактивно- и флуоресцентно-меченых лигандов. В рамках данного проекта разработаны молекулярные зонды, которые представляют собой гибридные конструкции, включающие один из трех змеиных токсинов (α-бунгаротоксин, α-кобратоксин или нейротоксин NT-II) в сочетании с красным флуоресцентным белком mKate2. Эти химерные белки были получены в бактериальной системе экспрессии и очищены с использованием гель-фильтрации. С помощью конкурентного радиолигандного анализа с радиоактивно-меченым α-бунгаротоксином установлено, что полученные зонды обладают высоким сродством к никотиновому ацетилхолиновому рецептору электрического органа ската : значения концентраций полумаксимального ингибирования находятся в наномолярном диапазоне. Флуоресцентные зонды были успешно использованы для визуализации ацетилхолиновых рецепторов на поверхности клеток линии SH-SYSY.

4 0